鞠熀先教师课题组在细胞聚糖成像切磋领域获得主要拓展,陈兴课题组在化学糖生物学领域取得进展

糖基化是普遍存在的翻译后修饰,蛋白质的糖基化模式决定了其结构、功能以及细胞识别和信号传导等过程,与细胞生理状态的动态响应、疾病的进程和状态密切相关。因此,对活细胞表面特定蛋白糖型的原位检测有助于加深对糖基化机制和蛋白功能的理解,也可为疾病特别是癌症的诊断和治疗提供靶标。

聚糖作为细胞基本组分之一,参与细胞粘附、细胞间通讯、信号转导、受体激活以及细胞内吞等一系列重要的生物学过程。蛋白质的糖基化不仅增加了蛋白质结构上的复杂性,也增加了功能的多样性。特定蛋白上的糖型表达与细胞特定生理功能间有密切联系,糖基化的动态变化也反映疾病进程和状态。因此,细胞表面糖基与特定蛋白上的糖型检测是当前生命分析化学领域的研究热点。

鞠熀先教师课题组在细胞聚糖成像切磋领域获得主要拓展,陈兴课题组在化学糖生物学领域取得进展。神经节苷脂是细胞表面糖链的一种重要分子形态,包含一个或多个唾液酸末端寡糖链,通过神经酰胺部分的烷烃链嵌在细胞膜上,在高特异性酶作用下增减糖单元,动态地在细胞表面合成和降解,调节细胞结构、细胞粘附和信号传导,并作为微生物毒素、细菌和病毒的受体,与细胞生命过程密切相关。神经节苷脂异常的糖基化通路与遗传性疾病、肿瘤组织恶性转化等疾病相关。不同亚型的神经节苷脂异常过表达还与肿瘤的类型和进程密切相关。因此,筛查细胞表面的神经节苷脂对揭示其相关的生物过程和潜在的肿瘤进程具有重要的意义。

聚糖作为组成细胞的生物大分子之一,参与调控许多重要的生理和病理过程。相对核酸和蛋白质而言,聚糖具有结构复杂、形式多样等特点,因而对其功能的解析极具挑战性。近年来,化学与糖生物学的交叉研究快速发展,为聚糖的合成、分析和调控提供了新的有力途径。

生命分析化学国家重点实验室的鞠熀先教授课题组自2007年以来,积极开展这一挑战性课题的研究,先后在国家自然科学基金重大研究计划、重点项目和973项目资助下,通过设计两表面一分子竞争识别策略和聚糖电化学检测芯片,提出细胞表面糖基原位检测的系列方法(J.
Am. Chem. Soc. 2008, 130, 7224; Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48,
6465等),曾获2013年教育部自然科学一等奖。同时,通过组装P-糖蛋白抗体功能化仿生界面,提出电极界面上细胞检测新方法;并引入化学选择性聚糖识别,提出细胞表面多种聚糖的同时定量和聚糖密度的分析策略,是2016年江苏省科学技术一等奖的主要内容。2015年以来,该研究组在细胞表面特定蛋白糖型的成像方法学研究方面取得重要进展,发展了特定蛋白质上的糖基与多种糖型的原位检测方法(Chem.
Sci. 2015, 6, 3769; Chem. Sci. 2016, 7, 569; Anal. Chem. 2016, 88, 2923;
Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55,
5220)。近期,他们用核酸适配体标记半乳糖氧化酶,利用Apt识别细胞表面特定蛋白质和GO的活性开关,构建了一种局域聚糖化学重构策略,实现了活细胞表面特定蛋白的糖型成像,于2017年5月29日在线发表(Angew.
Chem. Int. Ed. DOI: 10.1002/anie.201703406)。

生命分析化学国家重点实验室鞠熀先教授课题组自2007年承担国家自然科学基金重大研究计划以来,积极开展这一挑战性课题的研究,先后在该计划与973项目、国家自然科学基金重点项目资助下,通过设计一系列分子识别和标记新体系与两表面一分子竞争识别策略,提出多种细胞表面糖基原位检测的系列方法(J.
Am. Chem. Soc. 2008, 130,
7224等),实现了细胞表面多种聚糖的动态监测(Angew. Chem. Int. Ed. 2009,
48, 6465等)。Nat. China曾对其工作作亮点介绍,MIT学者在Acc. Chem. Res.
评价该组工作称“鞠组做出了这个领域的一项奠基性工作”。

我校生命分析化学国家重点实验室的鞠熀先教授课题组从事细胞表面糖链研究已经十年,在细胞表面糖基的原位检测方法学研究领域提出了奠基性的成果(J.
Am. Chem. Soc. 2008, 130, 7224;Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 6465;
Anal. Chem. 2010, 82, 5804; Anal. Chem. 2012, 84, 1452;Chem. Sci. 2015,
6, 3769)。近两年该研究组发展了特定蛋白质上糖基的多种原位检测方法(Chem.
Sci. 2016, 7, 569,Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 5220; Angew. Chem.
Int. Ed. 2017, 56,
8139)。近期,他们针对神经节苷脂研究的迫切需求,设计了一对具有非破坏性提取和疏水收集功能的浮力微球探针,实现了细胞表面神经节苷脂的定量、亚型筛查与再生分析,于2017年12月4日在线发表(Angew.
Chem. Int. Ed. DOI: 10.1002/anie. 201710984)。

北京大学化学与分子工程学院的陈兴课题组致力于开发化学标记策略和成像手段,在活细胞和活体水平上揭示糖基化的生物学功能及其分子机理。这是化学糖生物学领域中很受关注的研究方向。在前期研究工作中陈兴课题组发展了一种具有细胞选择性的聚糖标记技术,实现了对癌症细胞表面聚糖的靶向性标记成像和富集鉴定(J.Am.Chem.Soc.2012,134,9914)。基于这些工作基础,他们最近在标记探针和成像技术上做了进一步的探索,取得了重要进展。

该局域聚糖化学重构策略由14级硕士研究生惠晶晶为第一作者、丁霖副教授和鞠熀先教授为通讯作者提出。他们以MUC1黏蛋白为研究模型,首先利用Apt与MUC1的特异性识别将亚铁氰化钾抑制的GO定位至MUC1上。然后用铁氰化钾激活GO,催化氧化细胞表面MUC1的末端半乳糖/N-乙酰半乳糖胺(Gal/GalNAc)生成醛基,通过醛基-生物素酰肼的快速反应将FITC标记在目标Gal/GalNAc上,用化学反应活性作为信号报告系统,实现了活细胞表面特定蛋白糖型的原位检测。与通常糖代谢标记技术相比,局域聚糖化学重构策略仅对目标蛋白上聚糖进行标记,标记过程与细胞自身功能无关,避免了代谢效率的异质性问题,为不同细胞系特定蛋白上糖型表达的研究提供了重要工具和方法模型。这是该课题组在细胞功能分子原位检测方法学研究领域的又一项重要进展。

2015年以来,该研究组在细胞表面特定糖蛋白上糖型的成像方法学研究方面取得重要进展(Chem.
Sci. 2015, 6, 3769; Chem. Sci. 2016, 7, 569;Anal. Chem. 2016, 88,
2923-2928)。近期,他们利用上转换纳米材料的近红外单色激发、多色发射的特点,结合糖代谢标记技术,通过在细胞表面的特定蛋白位点上建立单激发-双通道的发光共振能量转移体系,实现了特定糖蛋白上两种糖基的同时成像检测,于2016年3月22日在线发表(Angew.
Chem. Int. Ed. DOI: 10.1002/anie.201601233)。

该研究工作由助理研究员陈云龙为第一作者,鞠熀先教授为通讯作者于10月25日投稿,11月13日预录用。他们构建的一对功能化浮力微球包括提取探针和收集探针。提取探针以马来酰亚胺修饰的二氧化硅浮力微球为基底,在其上共价结合具有核酸内切酶切割位点和硼酸末端的DNA分子,通过硼酸与细胞表面唾液酸的共价识别作用,将细胞表面包含唾液酸的生物分子通过浮力提取。在核酸内切酶的作用下,被提取的生物分子被释放到溶液中,并由十八烷硅烷化的收集探针通过疏水作用收集其中的结合有核酸碎片的神经节苷脂,进一步利用体外杂交链反应对神经节苷脂进行荧光定量。用唾液酸剪切酶切除收集探针上收集的神经节苷脂中的唾液酸残基,通过荧光标记的凝集素识别残留聚糖,该工作发展了细胞表面神经节苷脂亚型的筛选鉴定方法,并第一次提出三种神经节苷脂亚型。利用提取探针对细胞表面唾液酸包含物进行不同程度地提取,可用这两种探针对细胞表面神经节苷脂的再生过程进行监测。与已有的神经节苷脂分析方法相比,该方法无需细胞破碎及其它预处理,首次实现了细胞表面神经节苷脂的定量筛查、亚类鉴定和再生分析,为揭示神经节苷脂相关的生命过程提供了重要工具。

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这一单激发双色成像策略由该课题组13级硕士研究生吴娜为第一作者、丁霖副教授和鞠熀先教授为通讯作者提出。他们以UNP为能量供体,通过适体的靶向识别作用标记到特定蛋白上;两种荧光受体分子通过click反应分别标记到细胞表面的两种糖基上。在980
nm激发下,UNP产生两个通道的发射光,分别与一定距离内的两种能量受体发生能量共振转移,通过点亮荧光受体分子指示目标糖基在该蛋白上的表达。该工作以肿瘤标志物黏蛋白MUC1为模型,对该蛋白上O-聚糖糖链的终止糖岩藻糖及唾液酸进行了同时成像,对比了三种乳腺上皮细胞系上终止糖的表达模式,并进一步以O-聚糖的糖链起始糖N-乙酰半乳糖作为内标糖,获得三种不同细胞系的黏蛋白MUC1上岩藻糖与唾液酸的相对表达。该策略为研究糖基化过程的信号转导机制提供了有力的工具,有助于开发新的基于聚糖表达的肿瘤标志物和治疗靶标,被两位审稿人分别评价为非常重要(Very
important, top 5%)和高度重要(Highly important, top
20%)。这也是该课题组在细胞功能分子检测方法学研究领域的一项重要进展。

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在最近发表于J.Am.Chem.Soc.(DOI:10.1021/ja402326z)的一项工作中,陈兴课题组开发了一种新型的双功能非天然唾液酸探针,用于研究唾液酸化聚糖与其结合蛋白质的相互作用。唾液酸是组成细胞表面聚糖的重要单糖分子之一,通常位于聚糖的最外端。含有唾液酸的聚糖分子在细胞迁移、病原体与宿主相互作用等过程中扮演了非常重要的作用,这些功能的发挥都依赖于唾液酸与其结合蛋白的相互识别和作用。为了对唾液酸结合蛋白进行高通量的捕获和研究,他们设计合成了同时含有两种功能基团的唾液酸类似物,并验证了这些双功能唾液酸探针可以被细胞代谢,用于唾液酸化聚糖的代谢标记。当功能基团为两种生物正交反应基团时,这种双功能唾液酸可以被用于聚糖的多色成像和细胞表面糖蛋白周转的动态检测。当双功能唾液酸同时含有生物正交反应基团和光交联基团时,可用于进行唾液酸结合蛋白的捕获、富集和鉴定。该工作与北大生科院谢灿课题组和深圳研究生院赵劲课题组合作完成。

图1. 局域聚糖化学重构策略的原理示意图

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图1. 功能浮力微球探针的制备和细胞表面神经节苷脂定量分析原理

目前针对聚糖的成像手段通常需要利用生物正交反应对聚糖进行荧光标记。但由于生物正交反应必须满足十分严苛的要求,只有少数几种化学反应符合“生物正交”的条件。陈兴课题组提出了“生物正交拉曼标记”的概念,结合拉曼成像技术,实现对聚糖的直接标记与成像,从而无需使用生物正交反应。他们设计并合成了含有“生物正交拉曼基团”的非天然糖探针。“生物正交拉曼基团”定义为该基团的拉曼振动信号落在细胞的“拉曼静默区间”,即细胞中的天然生物分子在此期间无拉曼信号。运用这些非天然糖和表面增强技术,他们实现了细胞表面唾液酸化聚糖的直接拉曼检测和成像。聚糖的拉曼检测方法有望与荧光技术互补,用于研究一系列不同的糖基化过程。该成果最近发表于Angew.Chem.Int.Ed.(DOI:10.1002/anie.201301387),并被评选为当期的内封面。这项工作与厦门大学化学学院的田中群课题组合作完成。

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365bet体育在线滚球 ,图1. 在细胞表面的特定蛋白上构建D-LRET体系用于双糖的同时成像

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以上工作均得到了自然科学基金委员会和科技部的经费支持。

图2.
利用局域聚糖化学重构策略对MCF-7和T47D细胞上MUC1的末端半乳糖/N-乙酰半乳糖胺进行原位检测

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图2. 细胞表面神经节苷脂亚型的鉴定原理和分析结果

个人简介:

(化学化工学院 科学技术处)

图2. 三种不同乳腺上皮细胞表面MUC1上岩藻糖和唾液酸的同时成像

(化学化工学院 科学技术处)

陈兴,2010年9月加入北京大学化学与分子工程学院,任“百人计划”研究员,从事化学生物学研究和教学工作。2011年5月入选北大?清华生命科学研究中心PI。目前的研究兴趣主要集中于化学糖生物学领域。近期获DuPontYoungProfessorAward和SCOPUS青年科学之星等奖项。

(化学化工学院 科学技术处)

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